想洞悉细胞线粒体内部精细结构？全新SIM超分辨技术有话讲！

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生物圈的小伙伴肯定还记得前段时间的一则刷屏新闻：
北京大学陈良怡教授团队和华中科技大学谭山教授团队合作，成功发明了一种新型结构光照明超分辨显微成像技术——海森结构光照明显微镜。研究成果于高水平学术期刊Nature Biotechnology（IF＝41．67）进行了发表。
2 a: R0 H9 t0 U$ L3 G# ?8 m! ~之所以轰动，是因为该技术拥有超高的采集速度和灵敏度，以及低于共聚焦和其他超分辨成像方法（STORM／STED等）千分之一以上的光毒性和光漂白效应，成为了目前进行超长时间活细胞高速超分辨成像的利器。
而且，这个牛气哄哄的技术一经发明，便已经夺得生物成像领域的好几个“首次”：
- ?% m  ~' C+ N4 ~· 首次在活体细胞中清晰解析出线粒体的内膜结构，以及线粒体融合与裂解过程中内膜的动态变化；
· 首次观察到活体细胞中线粒体嵴与内质网之间的相互作用与运动；
( ^( w8 h8 @# t$ D· 首次通过连续成像的形式，捕捉到了完整的囊泡分泌与融合过程中的孔道及融合中间态。
那么究竟这台高大上仪器是怎样被研发而出？它爆炸性的技能点具体又是怎样？接下来我们就来深度解读一下啦！
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实时观察线粒体融合分裂及内膜动态变化
* m! t+ e" U6 ^从1994年Stefen W． Hell提出STED显微镜理论，到2014年三位科学家因为超分辨显微技术获得诺贝尔化学奖。短短20年间，超分辨成像可以说是声名大噪，各种超分辨成像平台也几乎成为了各大高校研究所的必备。
但是，一个奇怪的现象让北京大学的陈良怡教授产生了疑惑：虽然遍地开花，但由超分辨成像技术所带来的生物学新发现却屈指可数。究竟是何种原因，限制了超分辨显微成像在生物研究领域大显身手？
目前，主流的超分辨成像技术主要有三类：
# Y3 q* g, @4 e- S: X( y1、基于可随机开关的单分子荧光闪烁定位的STORM／PALM方法；
2、基于荧光蛋白受激发射损耗原理的STED方法；
7 Y+ h: K4 l; f$ X$ c3、基于结构光调制与解调制图像信息的SIM方法。
其中，STED通过纯光学方法能够获得50 nm甚至更低的分辨率，不通过算法拟合重建，成像速率取决于共聚焦平台的振镜扫描速率。但是其明显的弊端在于用于激发样品的光功率是最强的（MW／cm2数量级，相当于100万个太阳同时在天上炙烤你的皮肤）。如此一来，既会对样品产生积累的光毒性，又容易在长时间的活细胞观察过程中使样品荧光淬灭。
STORM／PALM相对于STED来说光照条件要稍微温和一些（kW／cm2数量级，大概也就相当于1000个太阳吧），分辨率也能到50 nm以下。但由于获得一张超分辨图片需要基于成百上千张原始的单分子闪烁图像，并通过算法拟合重建。所以成像的速度也是制约其发展的重要原因。同时，STORM／PALM对于荧光标记物的选择是非常苛刻的，因此几乎不能在同一个样品上实现多个蛋白的超分辨观察。
但是另外一种超分辨率方法，基于莫尔条纹效应的SIM就不一样了！
7 `6 y9 U' E; ?基于傅里叶光学和算法重建，SIM能够用最低的光功率（W／cm2数量级）获得长时间的活细胞超分辨图像。同时它对荧光标记物也无选择性，可以轻松实现多标记物观察。最重要的是由于重建一张超分辨图像只需要9－15张原始图像，因此SIM也是在相同成像视野下最快的超分辨方法。该方法非常适合生物样品中快速生物学过程的记录，如细胞内膜系统和细胞骨架的动态学研究、离子成像以及神经放电等等。
/ Q; ?! c8 D$ F/ r不过SIM也有一个明显的劣势——只能达到100 nm左右的分辨率。虽然使用非线性SIM成像可以使分辨率媲美其他两种方法，但代价则是需要使用很强的激发光，失去了活细胞观察的优势。
6 }! r& b) [& t# ^; ^5 A  g看准了SIM成像的优势，陈教授团队便开始着手进行线性SIM方法的优化。为了达到88 nm，188 Hz的优良性能，他们主要在以下几个方面做出了努力：
1、使用高NA的物镜，提升极限分辨率，尽可能多的接收光信号
提升成像系统的NA值一直是提高系统分辨率的不二法门。通过使用NA值高达1．7的油镜，再加上SIM方法本身的2倍分辨率提升，Hessian－SIM系统的最佳分辨率可以达到88 nm。
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- p* m! f7 C7 q3 ]! V使用更高数值孔径的物镜可以明显提升光学系统的OTF，使其在傅里叶频域空间能探测更高频的信号。在二维的频域空间中，越靠近中央亮点的区域，代表图像越低频的部分，可以看到NA值越高越能覆盖到边缘的高频区域。
' x- N8 U4 D9 U同时，NA值越大的物镜接受光信号的能力也越大，这样就可以最大限度降低激发光功率，或者使用尽可能短的曝光时间以期达到高速成像的目的。
2、改良了传统SIM方法产生衍射光栅的方法
2D－SIM成像需要通过产生两束互相干涉的光来形成三种不同偏振方向，且光强在空间上呈正弦变化的结构光。在传统的SIM成像方法中，这一过程除了要依靠液晶硅基的空间光调制器（LCOS－SLM）对光相位进行调制之外，还需要一种特殊的光学器件来改变光的偏振方向——旋偏器（polarization rotator）。但这个器件本身的响应时间是ms数量级的，所以成为了高速SIM成像的一个限制因素。
! J" C5 {& f: x; |而陈教授团队自主设计了新的偏振旋转玻片阵列，使其可以更好的配合SLM和相机曝光，使得激发光的偏振方向做最快速的切换。
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' u3 _9 _3 X8 |* }% a! h图中PR所示部分即旋偏器，b中上下两部分的双向箭头分别表示入射光和经过旋偏器后光的偏振方向。
3、极大程度的降低图像采集和重构过程中产生的Artifact
2 W/ F' T! h3 W$ o( R我们都知道在SIM方法中，算法重建也起着相当重要的作用。但是在解卷积的算法中，计算机或者说软件对信号和噪音的解读是“一视同仁”的。换句话说它很难自己告诉自己哪些地方是信号，哪些地方是噪声。
所以，为了将SIM成像的低光漂泊和光毒性优点发挥到极致，不得不克服在弱光低信噪比情况下算法所重建出来的Artifact。为了应对相应的问题，谭山教授团队提出了一种能够基于生物样品结构相关的先验知识来屏蔽噪音信号的重建算法——Hessian解卷积算法。

这个就是Hessian解卷积算法的最优解形式，以及其中的Hessian罚分矩阵
我们知道，样品信号除了在xy平面上具有连续结构之外，当其每一帧的运动距离小于系统空间分辨率时，它在xyt的时空上也是连续的。相反，背景噪声在重建后形成的Artifact则是时空分布随机和无特定形态的，因此通过这一标准就可以很好的去除这些Artifact。
9 J+ `$ t  t/ I5 N: ~4 l通过比较Hessian解卷积算法和其他几种经典和常见的SIM重构算法（如Wiener、TV－SIM、fairSIM等），发现高速记录时的低信噪比图像在使用除Hessian之外的算法进行重构之后，均会有不同程度的Artifact产生（同样的情况在长时间激发引起的光漂泊现象中也能够观察到），而Hessian算法的表现则一如既往的好。

不同SIM解卷积算法重建超分辨图像的效果对比：样品为Lifeact－EGFP标记的微丝，曝光时间为0．5 ms，每组左图为0 s时刻的图像，右图为60 s时刻的图像。
此外，该系统也拥有超高的时间分辨率，并达到了188 Hz的帧速。有着这样的性能表现，其关键硬件——相机则应实现9倍以上的采集速度。
, g* g- T- a# Q: ?' T使用了第二代前照式sCMOS芯片，可在512×100的分辨率下进行2000帧／s的采集——作为目前科研领域最高速的CMOS相机，滨松sCMOS ORCA－Flash4．0 V3便是该系统的选择。
3 l& U/ p5 P! @' g虽然使用前照式芯片是保证成像速率的必要之举，但是也并没在灵敏度上大打折扣。滨松Flash4．0相机具有业内最低的读出噪音（0．8 e－），同时82％的高量子效率，可保证在低曝光时间的条件下得到相对高的图像信噪比。
针对现在流行的超分辨成像技术，其相机芯片也做了更加精细的定量校准，将像素之间的光响应差异（PRNU）和噪音的不均一性（DSNU）都降到最低。
值得一提的是，Flash4．0输出的图像一直以来都是未经任何处理的原始图像，不在原始数据层面对噪音或hotpixel进行插值或滤波。这样在输入到各种重建或拟合的算法模型中才能得到准确的结果，避免了再人为引入其他Artifacts。
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通过硬件创新和算法优化以及精确的时空信号控制，Hessian－SIM可以在低于传统SIM激发光功率的条件下，以更低的曝光时间进行图像采集，并对样品的原始信息高度还原。从而实现对细胞内瞬时变化的高速连续记录，或者对活细胞内部结构的长时观察。
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9 T  G4 n0 g: O, R在相同的光照条件下，以1 Hz频率进行拍摄1 h，传统SIM使用7 ms曝光，而Hessian－SIM使用0．5 ms曝光。
$ m  u9 W% S1 w1 ?# p3 `7 V陈良怡教授团队一直致力于对高端的生物成像技术进行革新性的改良和研发。除了解决超分辨成像的长时间或高速问题之外，早在2014年就与程和平院士就将双光子和光片成像技术结合开发出激发光片范围更大同时z轴分辨率更高的成像技术（Zong W， Chen L， et al．CellRes． 2014 Sep 26． doi： 10．1038／cr．2014．124）；2017年又针对双光子在神经生物学应用中的灵活性，开发出了现今质量最小的头戴式微型双光子显微镜（Zong W， Wu R， Li M， ChenL， et al． Nat Methods． 2017 May 29． doi： 10．1038／nmeth．4305），解决了行为学和活体显微观察的矛盾。
除了科研相机外，滨松的光电器件，如光电倍增管等，也参与到了这些重要研究中。以淬炼了60余年的光电探测技术，为发展更好的科研成像技术，贡献出滨松的一份力量。