光学显微镜的分类

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（一）、普通光学显微镜
普通生物显微镜由3部分构成，即：
  l. ?1 b3 K: E①照明系统，包括光源和聚光器；
②光学放大系统，由物镜和目镜组成，是显微镜的主体，为了消除球差和色差，目镜和物镜都由复杂的透镜组构成；
: ?: `9 j  K/ w( |. a; s! y③机械装置，用于固定材料和观察方便（图2-1）。

图2-1 尼康E-600显微镜
7 X. q5 f4 c+ R$ u2 c9 O显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨力（resolution）有关，分辨力是指显微镜（或人的眼睛距目标25cm处）能分辨物体最小间隔的能力，分辨力的大小决定于光的波长和镜口率以及介质的折射率，用公式表示为：
8 }# o! N8 L8 v8 ]$ MR=0.61λ /N．A． N．A．＝ｎsinα/2
式中：n=介质折射率；α=镜口角（标本对物镜镜口的张角），N.A.=镜口率（numeric aperture）。镜口角总是要小于180冢??詓ina/2的最大值必然小于1。
8 d. O! p: L# R$ C/ `$ X& H( X/ ~, G表2-1 及中介质的折射率
' r6 z7 L/ L1 P5 n) n. U& Q0 U介质
) n* ^9 y  T2 z2 o7 V6 n4 t1 u空气
9 p4 I2 i9 O) M! b# ?: s: F' p! S水
0 z; O, B; x( q& U香柏油
α溴萘
折射率
1
1.33
1.515
1.66
% Q# a" z" h9 K2 a制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。
对于干燥物镜来说，介质为空气，镜口率一般为0.05~0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。
普通光线的波长为400~700nm，因此显微镜分辨力数值不会小于0.2μm，人眼的分辨力是0.2mm，所以一般显微镜设计的最大放大倍数通常为1000X。
6 t4 }3 X, h8 A) c. _" z/ U" I（二）、荧光显微镜

# f! K5 R" l1 V- h+ N$ g, a5 }图2-2 尼康E800荧光DIC显微镜
细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜（图2-2，3，4）就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。

+ b/ z/ I1 T* {6 L: N图2-3 落射式照明原理
荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别：
1.照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上（图2-3）；
" ^* P& @  B# o8 r% L2.光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜；
3. 有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人目。

% f9 \6 ]" f  z1 H8 V- B图2-4 荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色），图片来自http://www.itg.uiuc.edu
# {* @# h) p* P$ v（三）、激光共聚焦扫描显微境
, l$ ^7 J" V) @) s. C) U
图2-5 激光共聚焦扫描显微镜
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图2-6 LCSM照片，蓝色为细胞核，绿色为微管，图片来自http://www.itg.uiuc.edu
' r5 @9 J, o* j' f/ ?3 \- q8 c激光共聚焦扫描显微镜（laser confocal scanning microscope，图2-5、6）用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。
6 t5 u+ P2 C2 {0 Z# b' g9 c) w系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。
  I1 j' v) u! k2 u激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。
（四）、暗视野显微镜
7 q5 T' O+ R) i2 T8 \暗视野显微镜（dark field microscope，图2-7）的聚光镜中央有当光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至 4~200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。
% W$ b& S& p/ C; t8 ?2 u
图2-7 暗视野照明方式
+ }5 ^+ G6 R$ s+ N+ Y（五）、相差显微镜
相差显微镜（phasecontrast microscope，图2-8、9）由P．Zernike于1932年发明，并因此获1953年诺贝尔物理奖。这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。
" Q/ v: B9 g7 r3 h& r0 ~2 e相差显微镜的基本原理是，把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4λ（波长），如果再增加或减少1/4λ，则光程差变为1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处：
0 B' p% G+ _: f. A/ B1 Z1. 环形光阑（annular  diaphragm） 位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。
2.相位板（annular phaseplate）在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。分为两种：
1. A+相板：将直射光推迟1/4λ，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变亮，形成亮反差（或称负反差）。
2.  B+相板：将衍射光推迟1/4λ，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差（或称正反差），结构比周围介质更加变暗。
7 `; V: O& W2 x; i: }
4 ?  m$ R3 H2 e图2-8 相差显微镜照明原理

图2-9 一种介壳虫的染色体（PCM照片）
（六）、偏光显微镜
偏光显微镜（polarizing microscope）用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等等。和普通显微镜不同的是：其光源前有偏振片（起偏器），使进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器（一个偏振方向与起偏器垂直的的起偏器），这种显微镜的载物台是可以旋转的，当载物台上放入单折射的物质时，无论如何旋转载物台，由于两个偏振片是垂直的，显微镜里看不到光线，而放入双折射性物质时，由于光线通过这类物质时发生偏转，因此旋转载物台便能检测到这种物体。
（七）、微分干涉差显微镜
& O# v8 h9 Q0 m; Q$ o1952年，Nomarski在相差显微镜原理的基础上发明了微分干涉差显微镜（differential interference contrast microscope）。DIC显微镜又称Nomarski相差显微镜（Nomarki contrast microscope），其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。
DIC显微镜的物理原理完全不同于相差显微镜，技术设计要复杂得多。DIC利用的是偏振光，有四个特殊的光学组件：偏振器（polarizer）、DIC棱镜、DIC滑行器和检偏器（analyzer）。偏振器直接装在聚光系统的前面，使光线发生线性偏振。在聚光器中则安装了石英Wollaston棱镜，即DIC棱镜，此棱镜可将一束光分解成偏振方向不同的两束光（x和y），二者成一小夹角。聚光器将两束光调整成与显微镜光轴平行的方向。最初两束光相位一致，在穿过标本相邻的区域后，由于标本的厚度和折射率不同，引起了两束光发生了光程差。在物镜的后焦面处安装了第二个Wollaston棱镜，即DIC滑行器，它把两束光波合并成一束。这时两束光的偏振面（x和y）仍然存在。最后光束穿过第二个偏振装置，即检偏器。在光束形成目镜DIC影像之前，检偏器与偏光器的方向成直角。检偏器将两束垂直的光波组合成具有相同偏振面的两束光，从而使二者发生干涉。x和y波的光程差决定着透光的多少。光程差值为0时，没有光穿过检偏器；光程差值等于波长一半时，穿过的光达到最大值。于是在灰色的背景上，标本结构呈现出亮暗差。为了使影像的反差达到最佳状态，可通过调节DIC滑行器的纵行微调来改变光程差，光程差可改变影像的亮度。调节DIC滑行器可使标本的细微结构呈现出正或负的投影形象，通常是一侧亮，而另一侧暗，这便造成了标本的人为三维立体感，类似大理石上的浮雕（图2-10）。

9 Y6 S9 i" Z6 t' A0 c& B图2-10 DIC显微镜下的硅藻（伪彩色）
5 `! w6 Z) i! b/ o; l（八）、倒置显微镜
组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上（图2-11），用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。
进入20世纪80年代以来，光学显微镜的设计和制作又有了很大的发展，其发展趋势主要表现在，注重实用性和多功能方面的改进。在装配设计上趋于采用组合方式，集普通光镜加相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体，从而操作灵活，使用方便。

图2-11 莱卡倒置显微镜
显微镜使细胞的结构，特别是一些较大的细胞器，如核、线粒体等，立体感特别强，适合于显微操作。目前像基因注入、核移植、转基因等的显微操作常在这种显微镜下进行。